清野 裸舞 扁果草叶绿体基因组特征分析
叶绿体是半自主性细胞器，具有寂然的遗传物资，常见于陆生植物、藻类和少数原活泼物。叶绿体基因组与线粒体基因组、核基因组比拟较而言清野 裸舞，在结构、基因数量和基因构成上愈加保守，进化速率相对适中[1]。叶绿体基因组有多种构型，最常见的结构是双链环状结构，包括短单拷贝区(small single-copy region， SSC)和长单拷贝区(large single-copy region， LSC)，这两个区域被一双反向访佛区域(inverted repeat， IR) 分开，形成典型的四分体结构[2]。高档植物叶绿体基因组苟简有110−130个编码基因，包含与光合营用、自我复制、怒放阅读框(open reading frame， ORF) 和一些其他卵白编码联系的基因[3]。有些植物叶绿体基因中包含两个内含子(如clpP、ycf3) 和外显子，内含子大部分为Ⅱ型内含子，随机在基因中会存在一个反式剪接结构的内含子。比年来，基于叶绿体全基因组的物种讲理及系统进化研究成为植物系统分类学的一个新趋势。
扁果草属附庸于毛茛科(Ranunculaceae)，共包括4个种(Isopyrum)，散播于亚洲和欧洲[4]。我国散播的扁果草属植物有两种，一种为扁果草(I. anemonoides Kar. et Kir.)，散播于我国甘肃南部、青海、新疆、西藏和陕西等地；另一种为东北扁果草(I. manshuricum Kom.)，散播于我国东北地区[5]。扁果草属植物是首要的中药材资源，在民间常用于散结消肿、解毒等方面，其主要药用身分苄基异喹啉生物碱具有抗炎症和免疫蜕变等作用[6]。比年来，跟着分子生物学的发展，越来越多的字据标明，基于分子系统学和样式学的物种讲理在好多植物类群中有较大各异。当今，国表里对扁果草属植物的研究主要连结在样式学、化学身分和药理活性等方面[7]，且已开荒了系统发育关系框架，但关于扁果草的叶绿体基因组研究仍处于一派空缺。扁果草与东北扁果草在样式上较相似，其主要各异连结在根和花瓣，东北扁果草根状茎上有渊博纺锤状小块根和密集的须根，花瓣下缘合生成浅杯状；而扁果草根状茎细长，横走，疏生少数须根，花瓣呈圆筒状。那么这两个物种是否为一个姐妹群?
基于此科知识题，本研究通过二代高通量测序时候，得回扁果草全基因组数据，对叶绿体基因组进行拼装、属目并绘画其基因组图谱，分析其叶绿体基因组结构特征、散在访佛序列、纯粹访佛序列(simple sequence repeat， SSR) 以及密码子偏好性。同期，比较分析扁果草与近缘种叶绿体基因组相似性和各异性，并开荒系统发育树，揭示扁果草属物种间的亲缘和进化关系。该研究充实了扁果草属植物叶绿体基因组数据，为扁果草属植物物种讲理与系统进化研究提供了基础府上。
1 材料与门径 1.1 实际材料采集与保存本研究材料扁果草采集于新疆维吾尔自治区吉木萨尔县渭沪沟林场，标本保存于新疆大学植物标本馆，叶片材料经硅胶干燥后保存于实际室。
1.2 二代测序和叶绿体基因组拼装、属目使用Illumina Hiseq平台进行基因组测序，最终得回原始测序数据。使用乳突拟耧斗菜(Paraquilegia anemonoides) 叶绿体基因组序列当作参考，遴荐NOVOPlasty[8]设施进行拼装，得回扁果草叶绿体全基因组，然后通过GeSeq对叶绿体基因组进行初步属目，用Sequin软件进行手动属目。使用在线软件OGDRAW绘画(https://chlorobox.mpimp-golm.mpg.de/GenBank2Sequin.html) 扁果草叶绿体全基因组图谱[9]。
1.3 叶绿体基因组基本特征与比较分析通过Geneious软件对叶绿体基因组的总长度及各个区域(LSC、SSC、IR) 的长度、基因构成(卵白编码基因、tRNA基因、rRNA基因、内含子、外显子)、碱基构成、GC (AT) 含量进行统计和比较分析，明白扁果草叶绿体基因组序列的特征。
期骗Reputer[10]软件量度扁果草叶绿体基因组散在访佛序列。即正向访佛(forward repeats， F)、反向访佛(reverse repeats， R)、互补访佛(complement repeats， C)、回环访佛(palindromic repeats， P)。最小访佛长度(minimal repeat size) 诞生为30，hamming距离(hamming distance) 为3。
纯粹访佛序列(SSR) 由长度1−6 bp访佛单位构成，散播于基因组各个区域[11]。SSR具有高度多态性，因此常当作群体遗传学和进化研究中的分子记号[12-14]。使用MISA (https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/index.php) 在线软件量度扁果草物种叶绿体基因组序列中的纯粹访佛序列的类型和数量[15]。通过MEGA 7.0软件对扁果草叶绿体基因组密码子的使用偏好性进行统计。
期骗Mauve软件对扁果草与近缘物种叶绿体基因组进行共线性分析，参数遴荐默许值。期骗Circoletto设施，以E值1e-10，分别对扁果草与东北扁果草两个物种叶绿体基因组进行比较，两个物种序列相似度按摄影似区域与相似长度使用不同的情态进行贯串，图中贯串线之间的空缺区域标明两个物种莫得相似性的区域。
1.4 系统发育分析从扁果草全基因组序列中索求出了nrDNA ITS序列和叶绿体基因片断(rbcL、matK、trnL-F)，并从NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 下载14个扁果草属近缘种序列(表 1)。基于nrDNA ITS序列和3个叶绿体基因片断(rbcL、matK、trnL-F )，通过MAFFT对15莳植物的叶绿体基因组序列完成序列比对，再使用MEGA 7.0进行校正，使用MrBayes v.3.2.1软件[16]，分别和并吞构建系统发育树，从而明确该物种的系统位置和最近缘物种。
2 效果与分析 2.1 扁果草叶绿体基因组的基本特征扁果草的叶绿体基因组与典型的陆地植物叶绿体基因组基本特征一样，均为典型的四分体结构，叶绿体基因组全长161 034 bp，由一双反向访佛区(IRA和IRB， 29 385 bp)，一个长的单拷贝区(LSC， 84 877 bp) 和一个短的单拷贝区(SSC， 17 387 bp) 构成(图 1)。扁果草叶绿体基因组的GC含量接近于其他植物叶绿体GC含量为38.8%；但其3个区域(LSC、SSC、IR) 的GC含量具有昭彰的各异，其中IR区的GC含量最高为43.8%，其次是LSC区为36.6%，而SSC区的GC含量最低，仅为32.4%。全体而言，IR区的保守性高于LSC区和SSC区，这可能是IR区的GC含量高于LSC区和SSC区而变成的。各分区的碱基组办法表 2。
2.2 扁果草叶绿体基因组的基因构成扁果草叶绿体基因组共包含130个基因，包括8个rRNA基因、37个tRNA基因和85个卵白编码基因。其中85个卵白编码基因可分为以下4个大类。第1类：45个与光合营用联系的基因，包括6个ATP酶基因、12个NADH氧化收复酶基因、6个细胞色素b/f复合体基因、5个光合系统Ⅰ基因、15个光合系统Ⅱ基因、1个二磷酸核酮糖羧化酶大亚基基因。第2类：除rRNA基因和tRNA基因外，有28个与自我复制联系的基因，包括4个RNA团员酶亚基基因、10个核糖体卵白大亚基基因和14个核糖体卵白小亚基基因。第3类：6个其他编码卵白质的基因。第4类：6个功能未知的基因(表 3)。内含子在基因抒发调控中起着首要作用，在扁果草叶绿体基因组中，共有12个卵白编码基因和6个tRNA基因含有内含子，除clpP、ycf3、rps12基因含2个内含子外，其余15个基因均含1个内含子，但大小存在一定各异。其中，trnK-UUU领有最大的内含子(2 534 bp)，matK卵白编码基因位于其中，这与其他绿色植物的一般特质相似(表 4)。
2.3 密码子偏好性分析使用MEGA 7.0软件分析扁果草叶绿体基因组卵白编码序列密码子的使用偏好性(图 2)，共量度了53 678个密码子，其中编码亮氨酸(Leu) 的密码子数量最多(5 251个， 9.78%)，编码色氨酸(Trp) 的密码子数量最少(712个， 1.33%)。在扁果草叶绿体基因组中有20种氨基酸，除色氨酸(Trp) 和甲硫氨酸(Met) 使用一个密码子TGG和ATG外，其余氨基酸均有2−6个同义密码子。亮氨酸(Leu)、精氨酸(Arg)、丝氨酸(Ser) 使用6个同义密码子，使用频率最高的密码子分别为TTG、AGA、TCT；丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)、苏氨酸(Thr)、缬氨酸(Val) 分别使用4个同义密码子，使用频率最高的密码子分别为GCT、GGA、CCA、ACA、GTT；异亮氨酸(Ile) 使用3个同义密码子，使用频率最高的密码子是ATT；半胱氨酸(Cys)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、苯丙氨酸(Phe)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、酪氨酸(Tyr) 均使用2个同义密码子，但使用频率并不议论，这9个氨基酸使用频率较高的密码子分别为TGT、GAT、GAA、TTT、CAT、AAA、AAT、CAA、TAT。效果标明，扁果草叶绿体基因偏好使用含有A、T碱基的密码子，密码子第3位也偏好以A和T收尾。
夫人每天都在线打脸 2.4 叶绿体基因组访佛序列分析扁果草叶绿体基因组中量度出44个散在访佛序列(表 5)。其中，正向访佛17个(38.6%)、回环访佛26个(59.1%)、反向访佛1个(2.3%)，未发现互补访佛(C)。在基因隔断区(petA-psbJ、psbT-psbN、ndhG-ndhI等)、基因编码区(psaA、psaB、ycf2等)、转运RNA (trnQ-UUG、trnS-GGA等) 和ycf3基因内含子区域访佛序列均有散播，尤其在基因ycf2中出现了多个嵌套的序列访佛。
2.5 扁果草叶绿体基因组SSR分析扁果草叶绿体基因组中共检测到47个SSR (表 6)，其中39个单核苷酸访佛，3个二核苷酸访佛，5个复杂核苷酸访佛，但未发现三核苷酸访佛、四核苷酸访佛、五核苷酸访佛和六核苷酸访佛。大渊博SSR位于LSC区(35个)，仅有少数散播在SSC区(6个) 和IR区(6个)。此外，大部分的SSR位于基因间区31个(65.96%)，其次是位于基因编码区8个(17.02%) 和基因内含子区8个(17.02%)，这讲明了SSR主要散播在基因隔断区。这些SSR主要为A/T构成的单碱基访佛，且该基因组的SSR具有极强的A、T偏好。
2.6 叶绿体基因组共线性分析期骗Mauve软件量度扁果草与近缘物种在叶绿体基因组水平的共线性关系(图 3)：扁果草和乳突拟耧斗菜有5个共性区域，其他8个物种仅有4个共性区域，叶绿体基因组均不存在倒位或重排征象。第1、2区域的长度特殊旁边，第3、4区域的长度存在一定的各异。欧亚唐松草(Thalictrum minus)、距瓣尾囊草(Urophysa rockii)、天葵(Semiaquilegia adoxoides)、蕨叶东说念主字果(Dichocarpum dalzielii)、乳突拟耧斗菜存在隔断区，其大小可能是变成区域长度产生各异的主要原因。两个扁果草叶绿体基因组相似性为95.51% (图 4)。在扁果草与东北扁果草叶绿体基因组存在多处空缺分割区域，基因间存在内含子隔断，且内含子在位置、数量和长度上存在显耀各异。
2.7 叶绿体基因组的系统发育分析及第扁果草在内的15莳植物进行系统发育树的构建，以白毛茛(Hydrastis canadensis) 当作外类群，基于nrDNA ITS序列以贝叶斯法构建的发育树包含12个节点，节点撑执率均大于75%，标明聚类效确实确度较高(图 5)。但是，通过系统发育分析发现扁果草属的几个物种并未如预期一样形成一个单系群，而是聚为两支，扁果草和假耧斗菜(P. microphylle) 以98%的撑执率聚在一个分支上，而I. thalictroides、东北扁果草聚在另一分支上，其撑执率也为100%。
基于matK、trnL-F和rbcL三个叶绿体基因组序列构建了系统发育树(图 6)。在系统发育树上15莳植物叶绿体基因组可分为两大类4个小类，东说念主字果属和白毛茛为一个大类，其他的12个种为另一大类，唐松草属物种爪哇唐松草(T. javanicum) 和粗壮唐松草(T. robustum) 聚于类Ⅰ；蓝堇草(Leptopyrum fumarioides)、假耧斗菜和扁果草聚于类Ⅱ；拟扁果草(Enemion raddeanum)、I. thalictroides、东北扁果草聚于类Ⅲ；天葵、无距耧斗菜(Aquilegia ecalcarata)、尖萼耧斗菜(A. oxysepala) 聚于类Ⅳ。基于nrDNA ITS (图 5) 与3个叶绿体基因片断(图 6) 的系统发育分析效果一致，扁果草与假耧斗菜均聚在一个支上，并与蓝堇草形成姐妹群，未与扁果草属中I. thalictroides和东北扁果草形成一个单系群，而且亲缘关系较远。
3 研究扁果草与扁果草属其他植物及毛茛科植物的叶绿体基因组相似，均为四分体结构(图 1)，包含1个LSC和SSC区以及2个IR区，稳健大渊博被子植物叶绿体基因组的结构特征[17]。扁果草叶绿体基因组长度为161 034 bp，东北扁果草基因组长度为151 243 bp，标明扁果草具有较大的叶绿体基因组。经常情况下，植物叶绿体基因组LSC区长度为80−90 kb，SSC区长度为16−27 kb，IR区长度为20−28 kb[18]。扁果草叶绿体基因组LSC区长度约为85 kb，SSC区长度约为17 kb，IR区长度约为29 kb，可见扁果草叶绿体基因组较大的原因主如果由较大的IR区的长度引起的。此外，扁果草叶绿体基因组卵白编码基因第3位密码子具有昭彰的A/T偏好性，这与其他高档植物相似。
访佛序列对基因组重排和变异具有首要道理，可能促进叶绿体基因组重排，增多种群遗传万般性。散在访佛序列可被应用到系统发育研究，并当作种群研究的遗传记号[19]。访佛序列渊博存在于基因隔断区(intergenic spacer， IGS)[20–22]，扁果草叶绿体基因组中共检测到44个散在访佛序列(表 5)，大渊博访佛序列散播在基因隔断区和ycf2基因中，而东北扁果草中共检测到49个散在访佛序列，其中35个正向访佛，14个回环访佛，未有反向访佛。叶绿体基因组记号在进化和分类学研究方面比核DNA记号更有上风，因为它们在大渊博植物中是母系遗传，突变率低[23-24]。由于叶绿体基因组SSRs具有高度的可访佛性和多态性，因而经常用于物种讲理和遗传分析。在扁果草叶绿体基因组中，共检测出47个SSR，其中包含单核苷酸访佛、二核苷酸访佛和复杂核苷酸访佛。在东北扁果草叶绿体基因组中，发现了与扁果草不异类型的35个SSRs。
倒位是引起毛茛科叶绿体基因陈列规章变化的主要原因[25]，之前研究显现，天葵和无距耧斗菜等8个物种中共存在5种不同长度的大片断倒位征象[26]。通过对扁果草与近缘种叶绿体基因组共线性分析发现，扁果草和乳突拟耧斗菜包含5个共性区域，但其余物种仅有4个共性区域，叶绿体基因组均不存在倒位或重排征象。通过Circoletto分别对扁果草与东北扁果草叶绿体基因组进行比较，其二者相似度为95.51% (图 4)，而且扁果草卵白编码基因数量比东北扁果草多7个，但扁果草并莫得与该属的东北扁果草聚为一支，而是与假耧斗菜形成一个小分支。这证据当今分别的扁果草属不是一个单系群，诚然扁果草与东北扁果草在样式上有一定的相似性，但遗传各异较大。应该将该属物种进行分类纠正惩处，将扁果草寂然为一个属，东北扁果草和I. thalictroides寂然为另一个属。
4 论断本研究期骗NOVOplasty、Sequin等软件进行扁果草叶绿体基因组拼装和属目，得回完好意思的叶绿体基因组序列。扁果草叶绿体基因组全长为161 034 bp，有130个基因清野 裸舞，包括85个卵白编码基因、37个tRNA基因和8个rRNA基因。叶绿体基因组中，共有44个散在访佛序列，以回环访佛和正向访佛为主，检测到47个SSR位点主要散播于基因隔断区(IGS)，以单碱基访佛为主，其主要由A/T构成。密码子偏好性分析标明，亮氨酸(Leu) 为使用频率最高的氨基酸(9.78%)，色氨酸(Trp) 为使用频率最低的氨基酸(1.33%)。基于叶绿体全基因组的共线性分析标明，扁果草与其他近缘种共线性邃密，均未发现倒位或重排征象。此外，系统发育分析显现，扁果草属不是一个单系群，扁果草并莫得与该属的东北扁果草和I. thalictroides 聚在一支，而是与假耧斗菜有很近的亲缘关系。该研究为扁果草属分子记号开发、种间讲理以及该物种的演化历程及分类学地位提供科学依据。
